产品货号:
ALH093
中文名称:
高纯酵母质粒大量提取试剂盒(100~180mL)
英文名称:
Yeast Plasmid Maxi Kit(100-180mL)
产品规格:
10次
发货周期:
1~3天
产品价格:
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本试剂盒采用改进SDS-碱裂解法裂解细胞并结合破壁酶特异消化酵母细胞壁,能快速从酵母培养液中分离出高纯度质粒DNA。酵母收集后,加入破壁酶去除细胞壁后,然后碱裂法裂解细胞,离心吸附柱内的硅基质膜在高盐、低PH值状态下选择性地结合溶液中的质粒DNA,再通过去蛋白液和漂洗液将杂质和其它细菌成分去除,最后低盐、高PH值的洗脱缓冲液将纯净质粒DNA从硅基质膜上洗脱。
- 离心吸附柱内硅基质膜全部采用特制吸附膜,柱与柱之间吸附量差异极小,可重复性好。克服了国产试剂盒膜质量不稳定的弊端。
- 不需要使用有毒的苯酚,氯仿等试剂,也不需要乙醇沉淀。快速,方便。
- 获得的质粒产量高、纯度好,可以直接用于酶切、转化、PCR、体外转录、测序等各种分子生物学实验。
组分 | 规格 | 保存 |
RNase A(10mg/mL) | 750μL | 4℃ |
破壁酶 | 1g | |
溶液YP1 | 70mL | |
溶液YP2 | 70mL | 室温 |
溶液YP3 | 100mL | |
去蛋白液PE | 64mL | |
漂洗液WB | 50mL | |
洗脱缓冲液EB | 20mL | |
吸附柱DC及收集管(50mL) | 10套 |
保存:2~8℃,有效期1年。
- RNase A保存在即用型甘油缓冲液中,常温运输,收到后,不超过25℃室温至少保存6个月,4℃保存12个月,长期保存放-20℃。
- 第一次使用时,可将试剂盒所带全部的RNase A加入溶液YP1后(终浓度100μg/mL)置于4℃可保存3个月左右。如果溶液YP1中RNase A时间较久失活了,提取的质粒可能有微量RNA残留,在溶液YP1中补加RNase A即可。
- 环境温度低时溶液YP2中SDS可能会析出,出现浑浊或者沉淀,可在37℃水浴加热几分钟即可恢复澄清,重新混匀,不要剧烈摇晃,以免形成过量的泡沫。
用户需要自备Sorbitol buffer(1M山梨醇,0.1M Na2EDTA,14mM β-巯基乙醇)。
- 配制方法:在600mL去离子水里面溶解182.2g山梨醇,加入200mL Na2EDTA(0.5M,pH8.0),不需要调节PH值,定容到1L,4℃保存。临用前加0.1% β-巯基乙醇(商品化的β-巯基乙醇摩尔浓度一般为14M)。
- 所有离心步骤如未加另外说明均在室温完成,使用转速可以达到8000×g(~9000rpm),带50mL转头的台式离心机。
- 通常酵母质粒拷贝数都很低,高拷贝质粒最大得率一般为每5mL培养物提取1μg左右的质粒。用于下游试验时通常建议使用量为:1~5μL用做PCR模板;5~10μL用于转化大肠杆菌,选择高效率的感受态细胞。
- 得到的质粒DNA可用琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测浓度与纯度。OD260值为1相当于大约50μg/mL DNA。电泳可能为单一条带,也可能为2条或者多条DNA条带,这主要是不同程度的超螺旋构象质粒泳动位置不一造成,与提取物培养时间长短、提取时操作剧烈程度等有关。本试剂盒正常操作情况下基本超螺旋可以超过90%。
- 菌体浓度检测一般OD 600值为1的时候,酿酒酵母细胞是1~2×107 cells/ml,由于菌种和分光度计不同即使同样细胞数量OD值变化也很大,以上仅供参考。
- 洗脱液EB不含有螯合剂EDTA,不影响下游酶切、连接等反应。也可以使用水洗脱,但应该确保批pH大于7.5,pH过低影响洗脱效率。用水洗脱质粒应该保存在-20℃。质粒DNA如果需要长期保存,可以用TE缓冲液洗脱(10mM Tris-HCl,1mM EDTA,pH8.0),但是EDTA可能影响下游酶切反应,使用时可以适当稀释。
- 第一次使用前请先在漂洗液WB瓶中加入200mL无水乙醇、去蛋白液PE瓶中加入40mL无水乙醇,充分混匀,加入后请及时在方框打钩标记已加入乙醇,以免多次加入。
- 将RNase A全部加入溶液YP1中,混匀,每次使用后置于2~8℃保存。
- 吸取使用量的Sorbitol buffer加入0.1%β-巯基乙醇,回复到室温备用。
- 取120~200mL酵母培养的菌液加入50mL离心管,8000×g(~9000rpm),离心1min,尽可能的倒干上清,收集菌体。
- 如使用50mL离心管,可以离心弃上清后,在同一个50mL管内加入更多的菌液,重复步骤1,直到收集到足够的菌体。
- 加入10mL Sorbitol buffer,轻柔吹打充分重悬细胞;加入0.1g破壁酶(破壁酶临用前用2mL Sorbitol buffer溶解),充分颠倒混匀,37℃温育1~2小时消化细胞壁,中间可颠倒数次帮助消化。
- 如果破壁效果不好导致质粒产量过低,可以加大破壁酶用量来提高酶工作浓度,还可以延长消化时间或者提高温度到45℃来提高效果,不适合破壁消化的酵母可选用Lyticase或者Zymolase或者其它方法如加玻璃珠涡旋振荡,反复冻融等。
- 8000×g离心2min,彻底吸除上清,加7mL溶液YP1重悬菌体沉淀,移液器吹打或者涡旋振荡至彻底悬浮。
- 如果有未彻底混匀的菌块,会影响裂解,导致提取量和纯度偏低。
- 加7mL的溶液YP2,温和地上下翻转6~8次使菌体充分裂解,室温放置4~5min。
- 温和地混合,不要剧烈震荡,以免基因组DNA剪切断裂!所用时间不应超过5min!以免质粒受到破坏。此时菌液应变得清亮粘稠。如果很浑浊,可能由于菌体过多,裂解不彻底,应减少菌体量。
- 加10mL溶液YP3,立即温和地上下翻转6~8次,充分混匀此时会出现白色絮状沉淀。8000×g离心10min,小心吸取上清至新管,避免吸取到漂浮的白色沉淀。
- 加入溶液YP3后应该立即混匀,以免产生SDS的局部沉淀。
- 如有漂浮白色沉淀,可用吸头撇开浮沫伸入液面下吸取,偶然吸到少量漂浮的白色沉淀也不影响实验结果,后续过滤漂洗过程中都会去除。
- 加入溶液YP3后应该立即混匀,以免产生SDS的局部沉淀。
- 将上一步得到的上清中加入吸附柱DC中,8000×g离心1min,弃滤液。
- 个别情况下离心机转子倾角较大,建议每次加入吸附柱的溶液体积为9mL(不超过,以防产生漏液现象)。直到所有混合溶液通过此吸附柱。
- 加入10mL去蛋白液PE(请先检查是否已加入无水乙醇!),8000×g离心1min,弃滤液。
- 加入10mL漂洗液WB(请先检查是否已加入无水乙醇!),8000×g离心1min,弃滤液。再加入10mL漂洗液WB,重复漂洗一次,弃滤液。
- 将空吸附柱放回收集管中,8000×g离心3min以干燥基质膜上残留乙醇。
- 该步骤为彻底去除吸附柱中残留乙醇,残留乙醇抑制下游反应并降低洗脱效率,降低质粒产量。
- 将吸附柱置于新的50mL离心管中,室温晾干2~3min,在吸附膜的中间部位加1mL洗脱缓冲液EB(洗脱缓冲液事先在65~75℃水浴中预热可提高产量),室温放置2min,8000×g离心1min,弃吸附柱。
- 推荐:为了增加质粒的回收效率,可将得到的溶液重新加入离心吸附柱中,室温放置1min,8000×g离心1min。洗脱两遍可提高浓度约10%。
- 洗脱体积越大,洗脱效率越高,如果需要质粒浓度较高,可以适当减少洗脱体积,但是需注意体积过小降低质粒洗脱效率,减少质粒产量(最小不应少于0.6mL)。
- 推荐:为了增加质粒的回收效率,可将得到的溶液重新加入离心吸附柱中,室温放置1min,8000×g离心1min。洗脱两遍可提高浓度约10%。
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